Sterilisasi merupakan bagian yang sangat penting dalam teknik in vitro, yaitu teknik membersihkan dan membebaskan suatu benda dari segala kehidupan mikroorganisme (protozoa, fungi, bakteri, dan virus). Sterilisasi adalah tahap kunci keberhasilan dalam metode kultur jaringan untuk itu dalam kultur jaringan harus dalam kondisi yang aseptis..
1. Sterilisasi Ruang
Salah satu ruang yang harus dijaga kesterilannya adalah ruang transfer yang digunakan untuk inokulasi, isolasi dan subkultur.sterilisasi ini harus dilakukan jika tidak ada kegiatan dalam ruang tersebut. Ruangan ini biasanya tidak terlalu besar agar proses sterilisasinya tidak lama dan mudah. Sterilisasi ruangan dilakukan dengan menyemprotkan alkohol 90%, dan sterilisasi lantai dengan kain pel yang dibasahi dengan alkohol 90% atau phenol. Sterilisasi ini mutlak dilakukan menjelang ruang inokulasi akan digunakan. Lampu ultraviolet dapat digunakan untuk sterilisasi ruang, dan biasanya selalu dinyalakan apabila ruang inokulasi tidak digunakan, serta dimatikan saat masuk dalam ruang ini (Edhi Sandra, 2013).
2. Sterilisasi Alat inokulasi (LAF cabinet)
Sterilisasi laminar dilakukan dengan spirtus atau alkohol 70%. Permukaan laminar sebelum mulai bekerja dibersihkan dengan tisu yang sudah dicelupkan alkohol 70%. Laminar yang dilengkapi dengan lampu UV, sebelum digunakan juga dinyalakan selama 1-2 jam untuk mematikan kontaminan yang ada di permukaan laminar. Hal serupa juga dilakukan setelah selesai melakukan penanaman atau inokulasi. Laminar harus tetap dijaga kebersihannya.
3. Sterilisasi Alat dan Media
Alat-alat yang akan digunakan dalam kultur jaringan dapat disterilkan dengan autoclave. Alat-alat gelas dan logam disterilkan dengan autoclave pada temperatur 121 derajat dan tekanan 1 atm, selama 30 menit, sedangkan sterilisasi bahan atau media kultur selama 15 menit. Alat- alat seperti pinset dan scalpel selain disterilkan dengan autoclave dapat dilakukan dengan pembakaran di atas api bunsen. Botol-botol yang akan disterilisasi sebelumnya ditutup dengan aluminium foil atau plastik dan diikat dengan karet. Aquadest disterilkan seperti sterilisasi alat selama 30 menit.
ada dua metode untuk sterilisasi media yang umum digunakan, yaitu dengan metode dengan autoclave dan filter membrane. media kultur, air destilasi dan campuran yang stabil dapat disterilisasi dalam autoclave dengan menggunalan wadah yang dituup dengan kapas, alumunium foil atau plastic. akan tetapi, larutan dari bahan-bahan yang bersifat tidak stabil harus menggunakan filter. umumnya media di autoclave pada tekanan 15 psi dengan suhu 121 derajat. untuk volume larutan perwadah yang sedikit (<100ml), waktu yang dibutuhkan adalah 15-20 menit, tetapi untuk jumlah yang besar (2-4 liter) selama 30-40 menit. tekanan jangan melebihi dari 20 psi karena dapat mengakibatkan dekmposisi karbohidrat dan bahan lain dalam media yang bersifat thermolible.
4. Sterilisasi Eksplan
Eksplan adalah bagian tanaman yang akan dikulturkan. Bahan eksplan dapat berupa organ, jaringan, maupun sel. Eksplan dari organ lebih mudah dikulturkan, misalnya : daun, batang, akar. Metode sterilisasi setiap eksplan berbeda, tergantung pada jenis tanamannya, bagian tanaman yang digunakan, morfologi permukaannya, umur tanamannnya, kondisi tanamannnya (sakit atau sehat pada saat pengambilan), musim saat pengambilan, dan lingkungan tumbuhnya. Pada prinsipnya, sterilisasi eksplan adalah mensterilkan dari kontaminasi mikroorganisme, tanpa mematikan eksplannya (Edhi Sandra, 2013). Pada metode kultur jaringan untuk perbanyakan anggrek, eksplan yang digunakan adalah biji anggrek yang berasal dari buah anggrek yang sudah tua dan belum pecah. Kondisi buah yang masih muda atau buah tua yang sudah pecah akan berbeda tehnik sterilisasinya. Buah anggrek yang sudah tua dan belum pecah, sterilisasinya dengan cara membakar buah di atas api bunsen, edangkan sterilisasi buah anggrek yang tua dan sudah pecah dilakukan dengan klorox. Setelah disterilisasi, buah disayat secara aseptik dan diambil bijinya untuk ditanam di media kultur (Edhi Sandra, 2013).
Daftar Pustaka
Edhi Sandra .2013. Cara Mudah Memahami dan Menguasai Kultur Jaringan. IPB Press.
Endang G. Lestari. 2011. Peranan Zat Pengatur Tumbuh dalam Perbanyakan Tanaman melalui Kultur Jaringan. Jurnal Biogen 7 (1):63-68
Hartmann, H.T., D.E. Kester, F.T. Davies Jr., and R.L. Geneve. 1997. Plant Propagation: Principle And Practices. Sixth Ed.
Pierik, R.M.L. 1987. In Vitro Culture of Higher Plants. Martinus Nijhoff Publishers. Dordrecht.The Netherlands.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar